免疫療法刺激固有的免疫系統(tǒng)對(duì)抗惡性細(xì)胞徹底改變了臨床上的癌癥治療模式，已成為多種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。鑒于RNA可以通過(guò)抑制、增強(qiáng)、替代甚至編輯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，且mRNA和siRNA療法在癌癥免疫治療中展現(xiàn)出具有巨大潛力，因此RNA可以應(yīng)用于沉默免疫檢查點(diǎn)基因、制造CAR-T細(xì)胞或者用作抗腫瘤疫苗等。然而，RNA療法在癌癥治療中的臨床應(yīng)用受到RNA本身的不穩(wěn)定性和各種生理屏障阻礙的限制。盡管存在這些挑戰(zhàn)，核酸藥物近年來(lái)獲得迅速的發(fā)展，特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在新型冠狀病毒COVID-19 疫苗的應(yīng)用進(jìn)一步增強(qiáng)了人們對(duì)RNA治療藥物在其他疾病治療應(yīng)用的信心。

當(dāng)下RNA介導(dǎo)的免疫療法仍然面臨著一些應(yīng)用阻礙：1、LNPs主要在肝臟中積累并被肝細(xì)胞內(nèi)化，從而限制了它們對(duì)其他器官和組織相關(guān)疾病的治療效用；2、LNPs存在穩(wěn)定性問(wèn)題，LNP需要超低溫儲(chǔ)存（例如BNT162b2：-60和-80 ℃；mRNA-1273：-15和-25 ℃），這對(duì)RNA藥物在全球運(yùn)輸、儲(chǔ)存和流通是個(gè)極大的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要探索替代策略以開發(fā)用于RNA遞送的臨床適用平臺(tái)技術(shù)。

2024年6月10日，華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院王均教授團(tuán)隊(duì)在材料科學(xué)領(lǐng)域國(guó)際刊物《Advance Functional Materials》上發(fā)表了題為“Long-Term Storage Stable Vesicle-Like Nanoparticles of Lipid and Polymer for siRNA and mRNA-Mediated Cancer Immunotherapy”的研究論交。第一作者：華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院的博士研究生陳超然，通訊作者：華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院許從飛教授、楊顯珠教授與王均教授。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用臨床批準(zhǔn)的材料兩親性聚合物PEG5K-b-PLGA11K、DLin-MC3-DMA和DOTAP，成功開發(fā)了用于siRNA和mRNA介導(dǎo)的癌癥免疫治療的VNP遞送平臺(tái)。篩選后的VNP體系的轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine RNAiMAX、LNP相當(dāng)（圖1g）。此外，因?yàn)镽NA被有效封裝在VNP的中空膠囊狀內(nèi)核中，即使在6個(gè)月的儲(chǔ)存期（-20 ℃）后VNP也能保持優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率（圖1hi）。

圖1 VNP-siRNA儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究

研究團(tuán)隊(duì)還建立了小鼠黑素瘤治療模型和小鼠B16-OVA腫瘤預(yù)防模型，分別用以評(píng)估VNP介導(dǎo)siRNA和mRNA遞送的體內(nèi)免疫治療效果。攜帶靶向PD-L1和CD47的siRNA的VNP能夠在小鼠皮下黑素瘤治療模型中增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞比例并改善巨噬細(xì)胞吞噬作用，從而表現(xiàn)良好的免疫治療效果（圖2ab）；攜帶表達(dá)OVA抗原mRNA的VNP疫苗在小鼠B16-OVA腫瘤預(yù)防模型中產(chǎn)生了強(qiáng)大的免疫效應(yīng)抗原，在多組織中都檢測(cè)到了特異性CD8+ T細(xì)胞，可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)（5/8小鼠出現(xiàn)完全緩解情況）和預(yù)防腫瘤肺轉(zhuǎn)移（幾乎100%）（圖2cdefg）。本研究開發(fā)出了具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率以及較長(zhǎng)的保質(zhì)期的RNA遞送平臺(tái)技術(shù)VNP，為探索新型RNA遞送系統(tǒng)提供了簡(jiǎn)便的策略。

圖2 VNP-RNA在腫瘤中的治療效果

附：VNP-siRNA的制備和表征

文中使用雙乳液法制備VNPs-RNA，其中兩親性 mPEG-b-PLGA、可電離脂質(zhì)和陽(yáng)離子脂質(zhì)溶解在有機(jī)相中，而siRNA作為模型 RNA 藥物溶解在無(wú) RNA 酶的水相中（圖3a）。為了確定用于RNA遞送的最佳VNP配方，初步研究了裝載效率與 DOTAP 和 DLin-MC3-DMA 的質(zhì)量比之間的關(guān)系。結(jié)果表明，siRNA 的裝載效率高度依賴于 DOTAP 的含量，加入1.0 mg DOTAP 后達(dá)到98%，因此，配方中固定DOTAP 的質(zhì)量為1.0 mg（圖3b）。隨后，研究了DLin-MC3-DMA 和 DOTAP 的質(zhì)量比對(duì) VNP-siRNA 性能的影響，結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)表明添加 DLin-MC3-DMA 對(duì) siRNA 的裝載效率影響微乎其微，粒徑和 zeta 電位略有增加。此外，研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是 VNP-siRNA 的主要內(nèi)化途徑，內(nèi)吞程度與 MC3/DOTAP 的質(zhì)量比直接相關(guān)，DLin-MC3-DMA 含量增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞攝取減少（圖3j）。

對(duì)VNP進(jìn)行體外篩選和體內(nèi)生物分布研究。體外篩選結(jié)果表明，在不同腫瘤細(xì)胞類型中，MC3/DOTAP 質(zhì)量比的增加有效地增強(qiáng)VNP對(duì)CD47 基因（在各種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可以逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用）的敲低效果，但不同細(xì)胞類型的最佳配方各不相同。體內(nèi)生物分布研究結(jié)果表明，當(dāng) MC3/DOTAP 的質(zhì)量比等于或小于1:1時(shí)，VNP 的腫瘤積累效果更好 (圖3f)。綜合考量，MC3/DOTAP 的質(zhì)量比以1:1形成最終 VNP配方，用于后續(xù)涉及免疫檢查點(diǎn)基因沉默的抗癌研究。

圖3 VNP-siRNA的制備和表征

注：f：（I）Heart,（II）lung,（III）liver,（IV）kidney,（V）spleen,（VI）tumor.